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標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)別：NY-行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（農(nóng)業(yè)）

　　關(guān)鍵詞：固氮菌肥料

　　標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：NY411—2000

　　標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)：固氮菌肥料*

　　標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)：農(nóng)業(yè)土壤化肥標(biāo)準(zhǔn)

　　頒布部門(mén)：

　　頒布日期：

　　實(shí)施日期：

　　========================================================

　　1范圍

　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了固氮菌肥料產(chǎn)品的分類(lèi)、技術(shù)要求、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、包裝、標(biāo)識(shí)、運(yùn)輸、貯存等。

　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于含有益的固氮菌、能在土壤和多種作物根際中固定空氣中的氮?dú)�，供作物氮素營(yíng)養(yǎng)，又能分泌激素刺激作物生長(zhǎng)的活體制品。本標(biāo)準(zhǔn)也適用于以固氮菌為主的含有能促進(jìn)固氮、生長(zhǎng)的植物促生根際細(xì)菌（PGPR）的復(fù)合固氮菌肥料。

　　2引用標(biāo)準(zhǔn)

　　下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文，通過(guò)在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時(shí)，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會(huì)被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。

　　GB/T625—1989化學(xué)試劑硫酸

　　GB/T629—1997化學(xué)試劑氫氧化鈉

　　GB/T1250—1989極限數(shù)值的表示方法和判定方法

　　GB/T6543—1986瓦楞紙箱

　　GB/T6682—1992分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

　　3定義

　　本標(biāo)準(zhǔn)采用下列定義。

　　31自生固氮菌

　　在土壤里能固定空氣中的氮，供作物氮素營(yíng)養(yǎng)，又能分泌激素刺激作物生長(zhǎng)的微生物。

　　32根際聯(lián)合固氮菌

　　既依賴(lài)根際環(huán)境生長(zhǎng)，又在根際中固定空氣中的氮?dú)�，�?duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生積極作用的微生物。

　　33固氮效能

　　固氮菌每消耗1g碳水化合物（糖）從空氣中攝取氮素的毫克數(shù)，固氮效能用mg氮/g糖表示。

　　4產(chǎn)品分類(lèi)

　　41按劑型不同分為液體固氮菌肥料、固體固氮菌肥料和凍干固氮菌肥料。

　　42按菌種及特性分為自生固氮菌肥料、根際聯(lián)合固氮菌肥料、復(fù)合固氮菌肥料。

　　5技術(shù)要求

　　51菌種

　　在含一種有機(jī)碳源的無(wú)氮培養(yǎng)基中能固定分子氮，并具有一定的固氮效能。菌體一般為短桿狀（固氮螺菌屬菌體呈螺旋狀），革蘭氏染色陰性。

　　511自生固氮菌

　　用固氮菌屬（Azotobacter）、氮單胞菌屬（Azomonas）的菌種，也可用莖瘤根瘤菌（Azorhizobiumcaulinodans）和固氮芽胞桿菌（Paenibacillusazotofixans）菌株。

　　512根際聯(lián)合固氮菌

　　可用下列菌種固氮螺旋菌（Azospirillum）；陰溝腸桿菌（Enterobactercloacae）經(jīng)鑒定為非致病菌的菌株；糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenesfaecalis）經(jīng)鑒定為非致病菌的菌株；肺炎克氏桿菌（Klebsiellapneumoniae）經(jīng)鑒定為非致病菌的菌株。

　　使用本準(zhǔn)則規(guī)定之外的菌種生產(chǎn)固氮菌肥料時(shí)，菌種必須經(jīng)過(guò)鑒定，并符合51要求。

　　生產(chǎn)固氮微生物肥料所使用的菌種，必要時(shí)還要進(jìn)行菌種染色鑒別（見(jiàn)附錄B）和菌種固氮效能測(cè)定（見(jiàn)附錄C）。

　　52成品技術(shù)指標(biāo)（見(jiàn)表1）

　　表1成品技術(shù)指標(biāo)

　　指標(biāo)劑型

　　液體固體凍干

　　項(xiàng)目

　　乳白或淡褐色液體，黑褐色或褐色粉狀，

　　外觀、氣味混濁，稍有沉淀，無(wú)濕潤(rùn)、松散，無(wú)異臭乳白色結(jié)晶，無(wú)味

　　異臭味味

　　水分，%—250!35030

　　pH值55!7060!7560!75

　　細(xì)度，過(guò)孔徑018mm標(biāo)準(zhǔn)篩5200

　　的篩余物，%#

　　有效活菌數(shù)，個(gè)/mL（個(gè)/g、個(gè)/501081010850108

　　瓶）$

　　雜菌率1），%$5015020

　　有效期，2），月#3612

　　1）其中包括10-6馬丁培養(yǎng)基平板上無(wú)霉菌。

　　2）此項(xiàng)僅在監(jiān)督部門(mén)或仲裁檢驗(yàn)雙方認(rèn)為有必要時(shí)才檢測(cè)。

　　6抽樣

　　按每一發(fā)酵罐菌液制成的產(chǎn)品為一批，逐批抽樣檢驗(yàn)。抽樣過(guò)程要嚴(yán)格避免雜菌污染。

　　61抽樣工具及用品

　　抽樣前預(yù)先準(zhǔn)備好無(wú)菌塑料袋（或塑料瓶）、金屬勺、剪刀、封口機(jī)、牛皮紙封樣袋、標(biāo)簽、抽樣封條和膠水。

　　62抽樣數(shù)量及抽樣方法

　　在成品庫(kù)抽樣，可按“”形分層設(shè)點(diǎn)抽取，抽樣以件為單位，小包裝產(chǎn)品以一包裝箱為一件。大包裝（30!50kg）產(chǎn)品以一袋（或一桶）為一件。抽樣件數(shù)由樣品基數(shù)的大小確定。1!10件，全部抽樣；11!200件，抽樣10件；201!400件，抽取20件；樣品基數(shù)大于

　　400件者，按超過(guò)部分的2%增加抽樣件數(shù)，但總件數(shù)不要超過(guò)40件。

　　每件包裝產(chǎn)品抽取一小袋，在無(wú)菌條件下每袋取樣200g。然后將所有樣品混勻，按四分法縮到2000g，分裝4袋，然后封口。每2袋為一份裝入牛皮紙封樣袋。

　　液體產(chǎn)品每件吸取10mL，一同放入無(wú)菌的三角瓶中，混勻后分成兩份，每份250mL。凍干產(chǎn)品，每件取一支放入無(wú)菌的三角瓶中，加無(wú)菌液體培養(yǎng)液，溶解混勻后分成兩份，每

　　份50mL。貼上標(biāo)簽和封條（一份被抽樣單位留存，一份交檢測(cè)中心檢測(cè)）。

　　7檢驗(yàn)方法

　　71儀器設(shè)備及試劑

　　711儀器設(shè)備

　　生物顯微鏡（10100）；

　　菌落計(jì)數(shù)器；

　　恒溫培養(yǎng)箱；

　　恒溫干燥箱，

　　恒溫?fù)u床；

　　滅菌鍋；

　　無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)；

　　酸度計(jì)；

　　試管%15mm150mm，%18mm180mm；

　　培養(yǎng)皿直徑9cm；

　　三角瓶500mL；

　　無(wú)菌吸管05、1、5、10mL；

　　玻璃刮刀；

　　濾紙；

　　酒精燈；

　　標(biāo)準(zhǔn)篩孔徑018mm和015mm；

　　1號(hào)羊毛畫(huà)筆；

　　無(wú)菌水；

　　無(wú)離子水。

　　712試劑

　　選擇培養(yǎng)基（見(jiàn)附錄A）；

　　剛果紅染液（05%）。

　　72成品檢驗(yàn)

　　721氣味檢驗(yàn)

　　取固氮菌肥料樣品打開(kāi)包裝，進(jìn)行感觀檢驗(yàn)。

　　722外觀檢驗(yàn)

　　將固體固氮菌肥料包裝打開(kāi)，裝在白色搪瓷盤(pán)中，將液體固氮菌肥料搖勻，在明亮光線下進(jìn)行感觀檢驗(yàn)。

　　723pH值測(cè)定

　　液體固氮菌肥料的pH值測(cè)定：取供檢菌液直接測(cè)定pH值，取三次測(cè)定結(jié)果的平均數(shù)。固體固氮菌肥料的pH值測(cè)定：取50mL燒杯一個(gè)，加入菌肥25g，無(wú)離子水25mL。通過(guò)磁力攪拌器使溶液均勻后用酸度計(jì)測(cè)定pH值。取三次測(cè)定結(jié)果的平均數(shù)。

　　724含水量測(cè)定

　　稱(chēng)取固體固氮菌肥三份，每份2000g，精確到001g，放入已稱(chēng)恒重的鋁盒中。置105干燥箱內(nèi)烘烤4h，移至干燥器內(nèi)，冷卻后稱(chēng)重。根據(jù)烘干前后質(zhì)量差按式（1）計(jì)算含水量。取三個(gè)樣品測(cè)定數(shù)的平均值。平行樣品絕對(duì)偏差應(yīng)低于1%。

　　含水量（m

　　%）=0-m1

　　m100…………………………（1）

　　0

　　式中m0———烘干前樣品質(zhì)量，g；

　　m1———烘干后樣品質(zhì)量，g。

　　725吸附劑顆粒細(xì)度測(cè)定

　　稱(chēng)樣1000g

　　（精確至001g），置于標(biāo)準(zhǔn)篩中（直徑分別為018mm或015mm），用水沖洗，用毛筆輕刷，至粉末不再通過(guò)為止。將篩余物置105!110溫度下烘干，稱(chēng)重。篩余物百分含量按式（2）計(jì)算：

　　篩余物（%）=篩余物量（1-樣品含水量百分?jǐn)?shù)）

　　樣品質(zhì)量100…………（2）

　　726有效活菌數(shù)和雜菌含量測(cè)定

　　采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定有效活菌數(shù)及雜菌率。

　　7261測(cè)定步驟

　　采樣應(yīng)不少于500g，從中稱(chēng)取1000g，加入帶玻璃珠的100mL的無(wú)菌水中（液體菌劑取10mL，加入90mL的無(wú)菌水中），靜置20min后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩

　　30min，即成母液的菌懸液。

　　用無(wú)菌吸管吸取5mL上述母液的菌懸液加入45mL無(wú)菌水中，混勻成110稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋?zhuān)謩e得到11102，11103，11104，11105等濃度（每個(gè)稀釋度必須更換無(wú)菌吸管）。

　　用05mL無(wú)菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液01mL，加至直徑為9cm平皿的選擇培養(yǎng)基（見(jiàn)附錄A）表面，用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻地涂于瓊脂表面，或取1mL不同稀釋度菌懸液加入培養(yǎng)皿內(nèi)，與瓊脂培養(yǎng)基混勻，每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度，每一稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)加無(wú)菌水的空白對(duì)照。28培養(yǎng)2!3d后每個(gè)稀釋度取5!10個(gè)菌落的菌體，涂片染色（見(jiàn)附錄B）。顯微鏡觀察識(shí)別后，選一個(gè)適宜稀釋度（菌落在30!300個(gè)之間的平板），計(jì)算出同一稀釋度三個(gè)平皿上菌落平均數(shù)。

　　雜菌數(shù)是指在選擇培養(yǎng)基上，除有效活菌外的其他菌的菌落數(shù)與馬丁培養(yǎng)基上霉菌數(shù)之和。馬丁培養(yǎng)基10-4稀釋度菌懸液加樣，操作步驟同樣品有效活菌數(shù)檢測(cè)操作。

　　7262允許差

　　平行樣品誤差按式（3）計(jì)算，并應(yīng)符合表2的規(guī)定。

　　*=%（x--x）

　　(n-1…………………………………（3）

　　式中*———單一標(biāo)準(zhǔn)差；

　　x———同一個(gè)稀釋度任一個(gè)平板測(cè)定值；

　　-x———同一個(gè)稀釋度平板測(cè)定的平均值；

　　n———重復(fù)次數(shù)。

　　表2平板上菌落數(shù)對(duì)應(yīng)的單—標(biāo)準(zhǔn)差

　　平板上菌落數(shù)，個(gè)/皿30!5051!99100!300

　　單一標(biāo)準(zhǔn)差，100200500

　　7263測(cè)定結(jié)果的計(jì)算

　　按式（4）、式（5）計(jì)算樣品的有效活菌數(shù)及雜菌率

　　有效活菌數(shù)（個(gè)/g）=菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù)母液菌懸液的體積（mL）

　　菌劑克數(shù)或毫升數(shù)

　　1

　　加樣量（mL）……………………………………………………………………………（4）

　　雜菌率（%）=雜菌數(shù)

　　有效菌數(shù)+雜菌數(shù)100……………………（5）

　　727有效期檢驗(yàn)在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的有效期到達(dá)前10d測(cè)定擾品各項(xiàng)指標(biāo)，方法同721!726。

　　8檢驗(yàn)規(guī)則

　　81檢驗(yàn)分類(lèi)

　　811產(chǎn)品出廠檢驗(yàn)

　　產(chǎn)品交貨時(shí)進(jìn)行的檢驗(yàn)。

　　812產(chǎn)品型式檢驗(yàn)

　　新產(chǎn)品鑒定或國(guó)家質(zhì)檢機(jī)構(gòu)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)。

　　82檢驗(yàn)項(xiàng)目

　　型式檢驗(yàn)的檢驗(yàn)項(xiàng)目按52要求進(jìn)行。出廠檢驗(yàn)不檢有效期。

　　83判定規(guī)則

　　831合格產(chǎn)品：

　　a）檢驗(yàn)結(jié)果符合52所規(guī)定的技術(shù)指標(biāo)的產(chǎn)品為合格產(chǎn)品；

　　b）產(chǎn)品有效活菌數(shù)符合指標(biāo)，雜菌率不符合指標(biāo)，但小于本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的兩倍時(shí)（液體10%、固體30%、凍干瓶4%），而且在馬丁培養(yǎng)基平板上霉菌數(shù)小于30105，其他指標(biāo)有一項(xiàng)不符合，也可判為合格產(chǎn)品；

　　C產(chǎn)品有效活菌數(shù)及雜菌率符合指標(biāo)，在水分、外觀、pH值、細(xì)度等次要檢測(cè)項(xiàng)目中，有3項(xiàng)不符合技術(shù)指標(biāo)，也判為合格產(chǎn)品。

　　832不合格產(chǎn)品

　　a）產(chǎn)品有效活菌數(shù)不符合技術(shù)指標(biāo)或投入菌種沒(méi)有完全相應(yīng)的檢驗(yàn)出，判為不合格產(chǎn)品；

　　b）產(chǎn)品雜菌率超過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的兩倍（液體10%、固體30%、凍干瓶4%），判為不合格產(chǎn)品；

　　c）產(chǎn)品有效活菌數(shù)符合指標(biāo)，雜菌率不符合指標(biāo)，但小于本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的兩倍時(shí)C液體10%、固體30%、凍干瓶4%），其他指標(biāo)有兩項(xiàng)不符合指標(biāo)，判為不合格產(chǎn)品；

　　d）產(chǎn)品檢驗(yàn)在馬丁培養(yǎng)基平板上霉菌數(shù)#30105，判為不合格產(chǎn)品；

　　e）產(chǎn)品水分、pH值、細(xì)度、外觀等次要檢測(cè)項(xiàng)目中，有4項(xiàng)不符合技術(shù)指標(biāo)，判為不合格產(chǎn)品。

　　833含有植物促生根際細(xì)菌（PGPR）的固氮菌肥料產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)，只測(cè)固氮菌數(shù)量，不測(cè)

　　植物促生根際細(xì)菌的數(shù)量，也不視其為雜菌。

　　834本標(biāo)準(zhǔn)中質(zhì)量指標(biāo)合格判斷，采用GB/T1250中修約值比較。

　　9包裝、標(biāo)識(shí)、運(yùn)輸和貯存

　　91包裝

　　911內(nèi)包裝

　　液體肥料小包裝用塑料瓶或玻璃瓶，大包裝用塑料桶。固體肥料用不透明聚乙烯塑料袋包裝。凍干菌劑用玻璃指形管真空干燥。

　　912外包裝

　　外包裝采用紙箱，紙箱質(zhì)量應(yīng)符合GB/T6543的要求。箱外用尼龍打包帶加固。

　　913每箱（袋）產(chǎn)品中附有產(chǎn)品合格證和使用說(shuō)明書(shū)，在使用說(shuō)明中標(biāo)明使用方法、用

　　量及注意事項(xiàng)。

　　92標(biāo)識(shí)

　　在包裝箱（袋）上印有產(chǎn)品名稱(chēng)、商標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)、肥料登記證號(hào)、生產(chǎn)單位、廠址、生產(chǎn)

　　日期、批號(hào)和凈重，并印有防曬、防潮、防凍等標(biāo)記，若有必要還要加印易碎、防倒置等標(biāo)

　　記。內(nèi)包裝上有產(chǎn)品名稱(chēng)、商標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)、肥料登記證號(hào)、有效菌含量、生產(chǎn)日期、有效

　　期、產(chǎn)品性能、使用說(shuō)明書(shū)及生產(chǎn)單位、廠址等。

　　93運(yùn)輸

　　適用于常用運(yùn)輸工具，運(yùn)輸過(guò)程中有遮蓋物，防止雨淋、日曬及35以上高溫。氣溫低于0時(shí)采取保溫措施，防止菌肥凍冰。運(yùn)輸過(guò)程中輕裝輕卸，避免包裝破損。

　　94貯存

　　產(chǎn)品貯存在陰涼、干燥、通風(fēng)的庫(kù)房?jī)?nèi)，最適溫度為10!25，不得露天堆放，以防雨淋和日曬，避免凍冰及長(zhǎng)時(shí)間35以上高溫。

　　以上高溫。

　　附錄A

　�。�(biāo)準(zhǔn)的附錄）

　　有效活菌數(shù)和雜菌（霉菌）測(cè)定的選擇培養(yǎng)基

　　A1固氮菌用阿須貝氏（Ashby）培養(yǎng)基

　　磷酸二氫鉀（KH2PO4）02g

　　硫酸鎂（MgSO4·7H2O）02g

　　氯化鈉（NaCl）02g

　　碳酸鈣（CaCO3）50g

　　甘露醇（CsH14O6）100g

　　硫酸鈣（CaSO4·2H2O）01g

　　pH70

　　A2固氮（莖瘤）根瘤菌培養(yǎng)基

　　乳酸鈉（C3H3O3Na）100g

　　磷酸氫二鉀（K2HPO4）167g

　　磷酸二氫鉀（KH2PO4）087g

　　氯化鈉（NaCl）005g

　　氯化鈣（CaCl2）004g

　　氯化鐵（FeCl3）0004g

　　硫酸鎂（MgSO4·7H2O）01g

　　酵母膏10g

　�。ɑ蚪湍阜�08g）

　　pH68

　　A3聯(lián)合固氮菌培養(yǎng)基

　　D-葡萄糖酸鈉（C6H11O7Na）50g

　　磷酸二氫鉀（KH2PO4）04g

　　磷酸氫二鉀（K2HPO4）01g

　　硫酸鎂（MgSO4·7H2O）02g

　　酵母膏10g

　�。ɑ蚪湍阜�08g）

　　氯化鈉（NaCl）01g

　　氯化鈣（CaCl2）002g

　　氯化鐵（FeCl3）001g

　　鉬酸鈉（Na2MoO4）0002g

　　pH68!70

　　A4馬丁培養(yǎng)基（測(cè)霉菌數(shù)）

　　磷酸氫二鉀（K2HPO4）10g

　　硫酸鎂（MgSO4·7H2O）05g

　　葡萄糖（C6H12O6·H2O）100g

　　蛋白胨50g

　　1%孟加拉紅水溶液〔四氯四碘熒光素

　�。–20H4ClI

　　44O5）〕33mL

　　每升培養(yǎng)基中加入01g氯霉素，一起滅菌。

　　注以上各培養(yǎng)基需蒸餾水1000mL，瓊脂18!20g

　　附錄B

　�。�(biāo)準(zhǔn)的附錄）

　　染色劑和染色方法

　　B1莢膜染色法

　　B11染色劑

　　石碳酸復(fù)紅染色液

　　甲液：堿性復(fù)紅（Basicfuchsin）

　�。–20H20ClN3）03g

　　95%酒精（CH3CH2OH）100mL

　　乙液：石碳酸（C6H5OH）50g

　　蒸餾水950mL

　　a）將堿性復(fù)紅在研缽中研磨后，逐漸加入95%酒精，繼續(xù)研磨使之溶解，配成甲液。

　　b）將石碳酸溶解在蒸餾水中配成乙液。

　　c）把甲液和乙液混合搖勻，成為石碳酸復(fù)紅，通�？蓪⒒旌弦合♂�5!10倍使用。

　　稀釋液易變質(zhì)失效，一次不宜多配。

　　B12染色方法

　　B121取少量培養(yǎng)菌涂于載玻片水滴中，涂成薄層。

　　B122自然干燥或稍加熱。

　　B123在石碳酸復(fù)紅染1min后，水洗，干后鏡檢。

　　B13染色結(jié)果

　　菌體為紅色，菌體周?chē)幸粚油该魅礊榍v膜。

　　B2芽胞染色法

　　B21染色劑

　　B2115%孔雀綠

　　孔雀綠（C23H25ClN2）50g

　　蒸餾水100mL

　　B212005%堿性復(fù)紅

　　堿性復(fù)紅（C20H20ClN3）05g

　　95%酒精100mL

　　B22染色方法

　　B221制片。

　　B222加孔雀綠染液3!5滴于涂片處，酒精燈火焰加熱至冒汽，但不沸騰，并隨時(shí)補(bǔ)加

　　染液，維持涂片處不干，染色約5!10min。

　　B223自來(lái)水沖洗30s。

　　B224用005%堿性復(fù)紅染色1min，水洗，鏡檢（若005%堿性復(fù)紅濃度太高，可根據(jù)

　　具體情況適當(dāng)稀釋?zhuān)?br>
　　B23染色結(jié)果

　　芽胞綠色，菌體紅色。

　　B3革蘭氏染色法

　　B31染色劑

　　B311結(jié)晶紫染色液

　　甲液結(jié)晶紫（C25H30ClN3·9H2O）20g

　　乙醇（95%）

　�。–H3CH2OH）20mL

　　乙液：草酸銨〔（NH4）2C2O4·H2O〕08g

　　蒸餾水80mL

　　甲、乙液相混，靜置48h后使用。

　　B312盧哥（Lugol）氏碘液

　　碘（I2）片10g

　　碘化鉀（KI）20g

　　蒸餾水300mL

　　先用少量（3!5mL）蒸餾水溶解碘化鉀，再投入碘片，待碘全溶后，加水100mL，配成母

　　液，使用時(shí)加兩倍水，稀釋成盧哥氏碘液。

　　B313脫色液：95%乙醇。

　　B314復(fù)染液：05%的番紅水溶液

　　25%番紅酒精溶液10mL

　　蒸餾水100mL

　　B32染色方法

　　B321制片。

　　B322滴加結(jié)晶紫液，覆蓋1min。

　　B323用水沖凈結(jié)晶紫液。

　　B324滴加碘液沖去殘水，并覆蓋1min。

　　B325用水沖去碘液，用吸水紙吸去水分。

　　B326加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，30s后水洗，吸去水分。

　　B327番紅染色液染10s后，自來(lái)水沖洗。干燥，鏡檢。

　　B33染色結(jié)果

　　革蘭氏正反應(yīng)菌體呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體呈紅色。

　　B4鞭毛染色

　　B41染色劑

　　甲液：丹寧酸（C76H52O46）50g

　　氯化鐵（FeCl3）15g

　　甲醛（15%）

　�。℉CHO）20mL

　　氫氧化鈉（NaOH）

　�。�1%）10mL

　　蒸餾水100mL

　　乙液：硝酸銀（AgNO3）2g

　　蒸餾水100mL

　　待硝酸銀溶解后，取出10mL備用，其余的90mL硝酸銀液中滴加濃氫氧化銨，則形成很濃厚的沉淀，再繼續(xù)滴加氫氧化銨到剛剛?cè)芙獬恋沓蔀槌吻迦芤簽橹�。再將備用的硝酸銀慢慢滴人，則出現(xiàn)薄霧，但輕輕搖動(dòng)后，薄霧狀的沉淀又消失，再滴入硝酸銀，直到搖動(dòng)后，仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止（如霧重，則銀鹽沉淀出，不宜使用）。

　　B42染色方法

　　421涂片：在載玻片的一端滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取斜面上少許菌苔，在載玻片的水滴中輕蘸幾下。將玻片稍?xún)A斜，使菌液隨水滴緩慢流到另一端，然后平放在空氣中干燥B422涂片干燥后，滴加甲液染3!5min，用蒸餾水沖洗。加乙液染30!60s，并在酒精燈上加熱，使其稍冒蒸氣而染液不干，然后用蒸餾水沖洗，干后鏡檢。

　　B43染色結(jié)果

　　菌體為深褐色，鞭毛為褐色。

　　附錄C

　�。�(biāo)準(zhǔn)的附錄）

　　菌種固氮效能測(cè)定方法

　　在500mL三角瓶中加入100mL無(wú)氮培養(yǎng)基（含糖1%即1g），121滅菌30min。無(wú)菌操作，每瓶接入兩環(huán)待測(cè)菌種（或1mL培養(yǎng)3d的培養(yǎng)液），放置搖床上振蕩（120r/min）

　　30培養(yǎng)5!7d后，取出定糖測(cè)氮。

　　定糖采用蒽酮光電比色法。

　　測(cè)氮采用半微量光電比色法。

　　C1蒽酮光電比色法

　　C11測(cè)定原理

　　糖類(lèi)遇硫酸即脫水成為醛類(lèi)，再變成呋喃衍生物，后者與蒽酮縮合，生成藍(lán)綠色化合物。于580!650nm處進(jìn)行比色測(cè)定（蒽酮可與單糖、雙糖、淀粉、糊精等反應(yīng)），該方法適

　　合于含糖量0003%以上的樣品。

　　C12試劑和儀器

　　分析中除有說(shuō)明外，限用分析純?cè)噭┖虶B/T6682中規(guī)定的三級(jí)水。

　　C121硫酸。

　　C12202%（m/V）蒽酮溶液：稱(chēng)取02g蒽酮于100mL硫酸中。充分?jǐn)嚢�，使其溶解�?br>
　　該溶液不穩(wěn)定，應(yīng)當(dāng)天配用。

　　C123葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱(chēng)取葡萄糖1000g，溶于水中，定容至1000mL，即為

　　1000mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。

　　C124分光光度計(jì)。

　　C13分析步驟

　　C131試樣處理

　　取發(fā)酵培養(yǎng)的菌液100!400mL（取決于含糖量），稀釋至10000ml，取此稀釋液100mL于比色管中，加水至200mL，每管加入蒽酮試劑400mL，搖勻，水浴加熱15min，使之充分顯色，冷卻后，于580!650nm處進(jìn)行比色測(cè)定，記錄吸光度，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。

　　C132標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

　　吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液100、200、400、600、800、1000、2000mL。于100mL容量瓶

　　中，加水至刻度，該液分別含糖10、20、40、60、80、100、200%g/mL。

　　吸取1.00mL放入比色管中，加水至2.00mL，按C1.3.1方法測(cè)定，記錄吸光度用標(biāo)準(zhǔn)系列的含糖量定義橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　C14分析結(jié)果的計(jì)算

　　100mL溶液的含糖量（X）按式（C1）計(jì)算：

　　X=（m1-m2）100

　　m10010-6…………………………（1）

　　式中：m1———標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的試驗(yàn)含糖量，%g/mL；

　　m2———標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的空白試驗(yàn)的含糖量，%g/mL；

　　m———吸取發(fā)酵溶液體積，mL。

　　C15允許差

　　a）取平行測(cè)定的算術(shù)平均值為測(cè)定結(jié)果；

　　b）平行測(cè)定結(jié)果的允許差不大于0005g/100mL。

　　C2固氮菌液全氮比色測(cè)定法

　　C21測(cè)定原理

　　在硫酸銅或硫酸鉀存在下，濃硫酸中加入菌液，并加熱使試樣全部有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮，與奈氏試劑反應(yīng)，于波長(zhǎng)420nm處進(jìn)行比色測(cè)定。

　　C22試劑和儀器

　　分析中除非另有說(shuō)明，限用分析純?cè)噭┖虶B/T6682中規(guī)定的三級(jí)水。

　　C221硫酸（GB/T625）。

　　C222雙氧水

　　C223氫氧化鈉（GB/T629）2mol/L溶液：稱(chēng)量8g氫氧化鈉溶于水中，定容至100mL。

　　C22440%（m/V）氫氧化鈉（GB/T629）溶液：稱(chēng)取40g氫氧化鈉溶于100mL。水中。

　　C22550%（m/V）酒石酸鉀鈉溶液：50g酒石酸鉀鈉溶于100mL水中。

　　C226奈氏試劑：71g碘化鉀，10g碘化汞（HgI2）溶于少量水中，另配16g氫氧化鈉溶于

　　70mL水中，冷卻后將前一溶液緩緩倒入氫氧化鈉溶液中，邊加邊攪拌，最后用水稀釋至100mL，靜置過(guò)夜，取清液儲(chǔ)于棕色瓶中。

　　C227催化劑：1000g硫酸鉀與100g硫酸銅共同研磨均勻，儲(chǔ)于廣口瓶中。

　　C228分光光度計(jì)。

　　C23分析步驟

　　C231試樣制備和測(cè)試

　　吸取固氮菌液100mL于30mL消化管中，加硫酸（C221）3mL，加01g催化劑（C227）和5滴雙氧水（C222）消煮至清亮，若反應(yīng)液久煮不清，可冷卻后加1!2滴雙氧水（C222），繼續(xù)煮至無(wú)色透明，取下冷卻。加少許蒸餾水，搖勻，滴加40%氫氧化鈉至出現(xiàn)氫氧化銅沉淀（約11!12mL），加酒石酸鉀鈉（C225）20滴，以去除氫氧化物沉淀掩蔽鈣鎂，將試管液全部轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，消化管洗滌液一并倒入容量瓶，稀釋至刻度，搖勻。過(guò)濾，濾液1000mL于比色管中，加氫氧化鈉（C223）100mL，加酒石酸鉀鈉100mL，加奈氏試劑3mL，搖勻，顯色2!3min后，即倒入比色杯中，于420nm處比色計(jì)測(cè)定。讀取吸光度。

　　C232標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

　　準(zhǔn)確稱(chēng)取在（1055）烘1h直至恒重的優(yōu)級(jí)純?cè)噭┝蛩徜@04716g，溶于水，稀釋至

　　100mL，該液含氮1mg/mL，取此液005、010、025、050、100、200mL。放入100mL容量瓶，用水稀釋至刻度，其含氮分別為050、100、250、500、1000、2000/%g/mL，取標(biāo)準(zhǔn)液各1mL放入比色管中，加水至2mL，按C131方法測(cè)定，記錄吸光度。

　　用標(biāo)準(zhǔn)液的氮含量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

　　C24分析結(jié)果的計(jì)算

　　氮（X）含量以g/100mL表示，按式（C2）計(jì)算

　　X=（m1-m2）1000

　　m10010-6………………………（C2）

　　式中m1———標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的試驗(yàn)含氮量，%g/mL；

　　m2———標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的空白試驗(yàn)氮含量，%g/mL；

　　m———吸取發(fā)酵溶液體積，mL。

　　C25允許差

　　a）取平行測(cè)定和算術(shù)平均值為測(cè)定結(jié)果；

　　b）平行測(cè)定結(jié)果的允許差不大于0005g。

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