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玉米種子純度檢驗標(biāo)準(zhǔn)



            中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
                            玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法  NY／T 449--2001
                                        Identification purity of maize variety
                                        using salting in protein eletrohporesis
            1范圍
              本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了玉米單交種及親本的真實性和品種純度的室內(nèi)檢測方法。
              本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米單交種及親本的真實性和品種純度鑒定。
            2引用標(biāo)準(zhǔn)

            下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文，通過在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。
              GB／T 3543.2－1995農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣
              GB／T 3543.5—1995農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度鑒定
              GB 4404.1－1996糧食作物種子禾谷類
            3定義
              本標(biāo)準(zhǔn)采用下列定義。
            3．1種子真實性
              供檢品種與文件記錄（如標(biāo)簽等）是否相符。
            3．2品種純度
              品種在特征特性方面典型一致的程度，用本品種的種子數(shù)占供檢本作物樣品種子數(shù)的百分率表示。
            ［GB／T 3543．5］
            3．3育種家種子
              育種家育成的遺傳性狀穩(wěn)定的品種或親本種子的最初一批種子，用于進(jìn)一步繁殖原種的種子。
            4原理
              從玉米種子中提取的鹽溶蛋白在聚丙烯酸胺凝膠的濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電泳分離的電荷效應(yīng)作用
            下進(jìn)行分離，通過染色顯示蛋白質(zhì)譜帶類型。不同玉米品種由于遺傳組成的不同，種子內(nèi)所含的蛋白質(zhì)種類有差異，這種差異可利用電泳圖譜加以鑒別，從而對種子真實性和品種純度進(jìn)行鑒定。
            5儀器設(shè)備及試劑
            5．1儀器設(shè)備
              電泳儀（500 V士5 V連續(xù)可調(diào)、0～400 mA連續(xù)可調(diào)、額定輸出功率200 W）、垂直板夾心式電泳槽、單籽粒粉碎器、天平（感量 0. 01g、0. 001g、0. 0001g各一臺）、酸度計、磁力攪拌器、高速離心機（5 000 r／min以上）、電冰箱、電爐、離心管（ 1. 5   mL）、離心管架、移液管（ 10 mL、5mL、2 mL各兩支）、微量進(jìn)樣器（ 5～I(xiàn)OO μL）、恒溫箱、觀片燈等。
            5．2試劑

            丙烯酸膠、N，N’一亞甲基雙丙烯酸胺、乳酸、乳酸鈉、甘氨酸、抗壞血酸、硫酸亞鐵、氯化鈉、蔗糖、甲基綠、基綠、三氯乙酸、過氧化氫、考馬斯亮藍(lán)R25O、無水乙醇、正丁醇等（所用試劑均為分析純，所用水均為去離子水）。
            6溶液配制
            6．1電極緩沖液
              稱取甘氨酸 6.00 g，倒入2 000 mL燒杯中，加入 1800 mL去離子水溶解，用 2.0 ml。乳酸調(diào)至pH3.3，再加去離子水定客至 2 000 mL，混勻。
            6．2樣品提取液
              稱取氯化鈉 5.80 g，蔗糖200.00 g，甲基綠0.1515 g，倒人 I000 mL燒杯中，加去離子水800 ml。溶解，加熱至微沸，放至室溫，再用去離子水定容至 I000 mL。在 4℃條件下保存。
            6.3分離膠緩沖液
              取1.43 mL乳酸鈉于 I000 mL燒杯中，加去離子水 980 mL，用乳酸調(diào)至pH3．0，再加去離子水定容至 IOOO mL，貯于棕色瓶中，在4℃條件下保存。
            6．4分離膠溶液
              稱取丙烯酸胺112.50g，N，N’一亞甲基雙丙烯酷胺3.75g，抗壞血酸0. 25g，硫酸亞鐵8.Omg，用分離膠緩沖液溶解，再用分離膠緩沖液定容至I000mL，過濾于棕色瓶中，在4℃條件下保存（不超過 14天）。
            6．5濃縮膠緩沖液
              取O．3O mL乳酸鈉于2OO mL燒杯中，加去離子水 90 mL，用乳酸調(diào)至pH5.2，再加去離子水定客至IOO mL，貯于棕色瓶中，在4℃條件下保存。
            6．6濃縮膠溶液
              稱取丙烯酸胺 6.00 g，N，N’一亞甲基雙丙烯酸胺 1. OO g，抗壞血酸 O.03 g，硫酸亞鐵0.8 mg，用濃縮膠緩沖液溶解，再用濃縮膠緩沖液定容至 IOO mL，過濾于棕色瓶中，在4℃條件下保存（不超過 6天）。
            6．7  3 ％的過氧化氫溶液
              取3O％的過氧化氫 lmL，加 9 mL去離子水，貯于棕色瓶中，在 4℃條件下保存。
            6．8染色液
              稱取考馬斯亮藍(lán)R25O 2． OO g，在研缽中用 IOO mL無水乙醇研磨溶解。過濾于棕色瓶中。取 IO mL該溶液，加入到 2OO ml，的 10％（W／V）三氯乙酸溶液中，混勻。
            7電泳操作
            7.1樣品制備
              按 GB／T 3543.2的要求，從送驗樣品中隨機分取玉米種子至少 IOO粒，用單籽粒粉碎器粉碎，放入1.5mL離心管中，用滴管加入與樣品體積相同的樣品提取液，搖勻，放置 5 min后．再搖一次，3O min后，用離心機離心（5 000r／min）15 min，取上清液用于電泳。
            7．2凝膠制備
            7．2．1膠室制備
              將預(yù)先洗凈晾干的玻璃板裝人膠條中，然后把膠條固定在垂直板電泳槽內(nèi)，保持水平，短板向正極，擰緊螺栓，備用。
            7．2．2封底縫
              根據(jù)電泳槽大小，取適量分離膠溶液于燒杯中，用微量進(jìn)樣器加入適量3％的過氧化氫溶液（一般每5 mL分離膠溶液加 2O μL，3％過氧化氫溶液），迅速搖勻，并從長玻璃板外測活玻璃板倒入，振動電泳槽 3次，放平。
           7.2.3灌分離
           膠底縫封住后，用濾紙條插入兩玻璃板之間，吸去團(tuán)聚合而析出的水；量取分離膠溶液適量，加入3％過氧化氫溶液（～般每 15 mL分離膠溶液加 3％過氧化氫 20μL）迅速搖勻；傾斜電泳槽，將分離膠溶液倒入兩玻璃板之間，高度距短玻璃板上沿 1.2 cm；放平電泳槽并在試驗臺上振動 3次后，迅速加入適量的正丁醇封住膠面。待凝膠聚合后，吸出分離膠表面上的正丁醇，并用去離子水沖洗膠面3次，用濾紙吸干。
            7．2．4灌濃縮膠
              量取濃縮膠溶液適量，加入 3％過氧化氫溶液（一般每 5 mL濃縮膠溶液加 3％過氧化氫溶液40 μL），迅速攪勻，倒入兩玻璃板之間，馬上插好樣品梳，樣品梳底部距分離膠頂部O．5 cm。
            7.2.5點樣
              濃縮膠聚合后，拔出樣品梳并將樣品槽清理干凈，用微量進(jìn)樣器在每個樣品槽中加入不同籽粒的樣品上清液  15 μL，每點一粒后，都要用去離子水清洗進(jìn)樣器  3次。
            7．2．6電泳

            加樣完畢后，倒入電極緩沖液，上槽電極緩沖液面要高于短玻璃板，下槽電極緩沖液面要高于鉑金絲；將電源線正極接上槽，負(fù)極接下槽；接通電源，采用 SOO V穩(wěn)壓進(jìn)行電泳，待甲基綠指示劑下移至膠底部邊緣時，關(guān)閉電源。
            7．2．7卸板
              倒出電極液，從電泳槽內(nèi)取出膠室，卸下膠條，啟開玻璃板，取出膠片，浸人染色液中。
            7．2．8染色
              在 3OC恒溫條件下染色 2～4 h。
            7.2．9洗板
              取出膠片，用O．5％的不加酶洗衣粉水洗凈。
            8結(jié)果計算
            8.1電泳測定值計算
              待整個供檢樣品電泳結(jié)束后，在觀片燈上鑒定膠片上電泳譜帶的特征和一致性，計數(shù)供檢樣品粒數(shù)和非本品種粒數(shù)，并按式（1）計算電泳測定值足
                                               供檢樣品粒數(shù)一非本品種粒數(shù)
                                      X（％）＝－－－－－－－－－－－－－×100％   ……………（1）
                                                      供檢樣品粒數(shù)
            8．2樣品純度值計算
              將電泳測定值X代入式（2）回歸方程，計算出樣品純度值廣，再將．與GB 44O4．l中的純度值進(jìn)行比較，判定樣品是否合格。
                                      Y＝52．9＋O．46lX               ……………………………（2）

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