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中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

固氮菌肥料

Azotobacter fertilizer

2000-12-22發(fā)布 2001-04-01實(shí)施

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā) 布

前言

本標(biāo)準(zhǔn)在原有標(biāo)準(zhǔn) NY227-1994《微生物肥料》的基礎(chǔ)上，對(duì)其中的固氮菌肥料部分進(jìn)行修改。

主要修改內(nèi)容如下：

—在技術(shù)要求中刪除成品無(wú)害化指標(biāo)；

—在檢驗(yàn)方法中增加允許差，并增加抽樣和判定規(guī)則。

本標(biāo)準(zhǔn)自實(shí)施之日起，同時(shí)代替 NY227-1994中的固氮菌肥料部分。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄 A、附錄B、附錄C都是標(biāo)準(zhǔn)的附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)部微生物肥料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李元芳、吳觀以、李慧荃、葛誠(chéng)、沈德龍。

固氮菌肥料

Azotobacter fertilizer

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了固氮菌肥料的分類、技術(shù)要求、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存等。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于含有益的固氮菌、能在土壤和多種作物根際中固定空氣中的氮?dú)?nbsp;,供作物氮素營(yíng)養(yǎng),又能分泌激素剌激作物生長(zhǎng)的活體制品。本標(biāo)準(zhǔn)也適用于以固氮菌為主的含有能促進(jìn)固氮、生長(zhǎng)的植物促生根際細(xì)菌(PGPR)的復(fù)合固氮菌肥料。

2 引用標(biāo)準(zhǔn)

下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文，通過(guò)在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時(shí)，所示版本均有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會(huì)被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。

GB/T 625一1989 化學(xué)試劑硫酸

GB/T 629一1997 化學(xué)試劑氫氧化鈉

GB/T 1250一1989 極限數(shù)值的表示方法和判定方法

GB/T 6543一1986 瓦愣紙箱

GB/T 6682一1992 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3 定義

本標(biāo)準(zhǔn)采用下列定義：

3.1 自生固氮菌

在土壤里能固定空氣中的氮，供作物氮素營(yíng)養(yǎng)，又能分泌激素刺激作物生長(zhǎng)的微生物。

3.2根際聯(lián)合固氮菌

既依賴根際環(huán)境生長(zhǎng)，又在根際中固定空氣中的氮?dú)�，�?duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生積極作用的微生物。

3.3 固氮效能

固氮菌每消耗 1g碳水化合物（糖）從空氣中攝取氮素的毫克數(shù)，固氮效能用mg氮/g糖表示。

4 產(chǎn)品分類

4.1 按形態(tài)不同，分為液體固氮菌肥料、固體固氮菌肥料和凍干固氮菌肥料。

4.2 按菌種及特性分為：自生固氮菌肥料、根際聯(lián)合固氮菌肥料、復(fù)合固氮菌肥料。

5 技術(shù)要求

5.1 菌種

在含一種有機(jī)碳源的無(wú)氮培養(yǎng)基中能固定分子氮，并具有一定固氮效能。菌體一般為短桿狀（固氮螺菌屬菌體呈螺旋狀），革蘭氏染色陰性。

5.1.1 自生固氮菌

用固氮菌屬（ Azotobacter）、氮單胞菌屬（Azomonas）的菌種，也可用莖瘤根瘤菌（Azorhizobium）和固氮芽孢桿菌（Paenibacillus azotofixans）的菌株。

5.1.2 根際聯(lián)合固氮菌

可用下列菌種：固氮螺菌（ Azospirillum）；陰溝腸桿菌（Enteroba）經(jīng)鑒定為非致病菌的菌株；糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）經(jīng)鑒定為非致病菌的菌株；肺炎克氏桿菌（Klebseilla pneumoniae）經(jīng)鑒定為非致病菌的菌株。

使用本準(zhǔn)則規(guī)定之外的菌種生產(chǎn)固氮菌肥料時(shí)，菌種必須經(jīng)過(guò)鑒定，并符合 5.1要求。

生產(chǎn)固氮微生物肥料所使用的菌種，必要時(shí)還要進(jìn)行菌種染色鑒別（見附錄 B）和菌種固氮效能測(cè)定（見附錄C）。

5.2 成品技術(shù)指標(biāo)(見表1)

表 1 成品技術(shù)指標(biāo)

項(xiàng)目
液體
固體
凍干

外觀、氣味
乳白或淡褐色液體，渾濁，稍有沉淀，無(wú)異臭味
黑褐色或褐色粉狀，濕潤(rùn)、松散，無(wú)異臭味
乳白色結(jié)晶，無(wú)味

水分， %
-
25.0 ~ 35.0
3.0

pH值
5.5 ~ 7.0
6.0 ~ 7.5
6.0 ~ 7.5

細(xì)度，過(guò)孔徑 0.18mm標(biāo)準(zhǔn)篩的篩余物，% ≤
2
20.0
-

有效活菌數(shù)，個(gè) /ml

(個(gè)/g、個(gè)/瓶 ) ≥
5.0×10 8
1.0×10 8
5.0×10 8

雜菌率 1）， % ≤
5.0
15.0
2.0

有效期 2），月 ≥
3
6
12

1）其中包括10 -6 馬丁培養(yǎng)基平板上無(wú)霉菌。

2）此項(xiàng)僅在監(jiān)督部門或仲裁檢驗(yàn)雙方認(rèn)為有必要時(shí)才檢測(cè)。

6 抽樣

按每一發(fā)酵罐菌液制成的產(chǎn)品為一批，逐批抽樣檢驗(yàn)。抽樣過(guò)程要嚴(yán)格避免雜菌污染。 6.1 抽樣工具及用品

抽樣前預(yù)先準(zhǔn)備好無(wú)菌塑料袋 (或塑料瓶)、金屬勺、剪刀、封口機(jī)(或封口膠帶)、牛皮紙封樣袋、標(biāo)簽、抽樣封條和膠水。

6.2 抽樣數(shù)量及抽樣方法

在成品庫(kù)抽樣，按“ ”形分層設(shè)點(diǎn)抽樣，抽樣以件為單位，小包裝產(chǎn)品以一包裝箱為一件。大包裝（30-50kg）產(chǎn)品以一袋（或一桶）為一件。抽樣基數(shù)由樣品基數(shù)的大小確定。1-10件，全部抽樣。11-200件，抽樣10件；201-400件，抽取20件。樣品基數(shù)大于400件，按照超過(guò)部分的2%增加抽樣件數(shù)�？偧䲠�(shù)不超過(guò)40件。

每件小包裝產(chǎn)品抽取一小袋，在無(wú)菌條件下每袋取樣 200g。將所有樣品混勻，按四分法縮到2000g，分裝4袋，然后封口。每2袋為一份裝入牛皮紙封樣袋。

液體產(chǎn)品每件吸取 10mL，一同防入無(wú)菌的三角瓶中，混勻后分成兩份，每份250mL。凍干產(chǎn)品，每件取一支防入無(wú)菌的三角瓶中，加無(wú)菌液體培養(yǎng)液，溶解混勻后分成兩份，每份50mL。貼上抽樣標(biāo)簽和封條（一份被抽樣單位留存，一份交檢測(cè)中心檢測(cè)）。

7 檢驗(yàn)方法

7.1 儀器設(shè)備及試劑

7.1.1 儀器設(shè)備

生物顯微鏡（ 10×100）；

菌落計(jì)數(shù)器；

恒溫培養(yǎng)箱；

恒溫干燥箱；

恒溫?fù)u床；

滅菌鍋；

無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)；

酸度計(jì)；

試管：ф 15mm×150mm，ф18mm×180mm；

培養(yǎng)皿：直徑 9cm；

三角瓶： 500mL；

無(wú)菌吸管： 1、2、5、10mL；

玻璃刮刀；

濾紙；

酒精燈；

標(biāo)準(zhǔn)篩：孔徑 0.18mm和0.15mm；

1號(hào)羊毛畫筆；

無(wú)菌水；

無(wú)離子水。

7.1.2 試劑

選擇培養(yǎng)基（附錄 A）；

剛果紅染液（ 0.5%）。

7.2 成品檢驗(yàn)

7.2.1 氣味檢驗(yàn)

取固氮菌肥料樣品打開包裝，進(jìn)行感官檢驗(yàn)。

7.2.2 外觀檢驗(yàn)

將固體固氮菌肥料包裝打開，裝在白色搪瓷盤中，將液體固氮菌肥料搖勻，在明亮光線下進(jìn)行感官檢驗(yàn)。

7.2.3 pH值測(cè)定

液體固氮菌肥料的 pH值測(cè)定：取供檢菌液直接測(cè)定pH值，取三次測(cè)定結(jié)果的平均數(shù)。

固體固氮菌肥料的 pH值測(cè)定：取50mL燒杯一個(gè)，加入菌肥25g，無(wú)離子水25mL。通過(guò)磁力攪拌使溶液均勻后用酸度計(jì)測(cè)定pH值。取三次測(cè)定結(jié)果的平均數(shù)。

7.2.4 含水量測(cè)定

稱取固體固氮菌肥料三份，每份 20.00g，精確到0.01g，放入已稱恒重的鋁盒中。置105℃干燥箱內(nèi)烘烤4h，移至干燥器內(nèi)，冷卻后稱重。根據(jù)烘干前后質(zhì)量差按式(l)計(jì)算含水量。取三個(gè)樣品測(cè)定數(shù)的平均值。平行樣品絕對(duì)偏差應(yīng)低于1%。

含水量 (%)=（m 0 -m 1 ）/m 0 ×100                       ………………(1)

式中： m 0 一烘干前樣品質(zhì)量，g

      m 1 一烘干后樣品質(zhì)量，g。

7.2.5 吸附劑顆粒細(xì)度測(cè)定

稱樣 10.00g(精確至0.01g)，置于標(biāo)準(zhǔn)篩中(直徑分別為0.18mm和0.15mm)，用水沖洗，用毛筆輕刷，至粉末不再通過(guò)為止。將篩余物置105~110℃溫度下烘干，稱重。篩余物百分含量按式(2)計(jì)算：

篩余物 (%)=篩余物質(zhì)量/（1-樣品含水量百分?jǐn)?shù)）/樣品質(zhì)量×100 ………(2)

7.2.6 有效活菌數(shù)及雜菌率的測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定固氮菌活菌數(shù)及雜菌率。

采樣應(yīng)不少于 500g，從中抽取10.00g，加入帶玻璃珠的100mL的無(wú)菌水中(液體菌劑取l0mL加入90mL的無(wú)菌水中)，靜置20min后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即成母液的菌懸液。

用無(wú)菌吸管分別吸取 5mL上述母液的菌懸液加入45mL無(wú)菌水中，混勻成1：10稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋，分別得到1：1×10 2 ，1：1×10 3 ，1：1×10 4 ，1：1×10 5 等濃度（每個(gè)稀釋度必須更換無(wú)菌吸管）。

用 0.5mL無(wú)菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1mL，加至直徑為9cm的選擇培養(yǎng)基（見附錄A）表面，用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻地涂于瓊脂表面，或取1mL不同稀釋度菌懸液加入培養(yǎng)皿內(nèi)，與瓊脂培養(yǎng)基混勻，每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度，每一稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)加無(wú)菌水的空白對(duì)照。28℃培養(yǎng)2~3d后每個(gè)稀釋度取5~10個(gè)菌落的菌體，涂片染色（見附錄B）。顯微鏡觀察識(shí)別后，選一個(gè)適宜稀釋度（菌落在30~300個(gè)之間的平板），計(jì)算出同一稀釋度三個(gè)平皿上菌落平均數(shù)。

雜菌數(shù)是指在選擇培養(yǎng)基上，除有效活菌外的其他種菌的菌落數(shù)與馬丁培養(yǎng)基上霉菌數(shù)之和。馬丁培養(yǎng)基 10-4稀釋度菌懸液加樣，操作步驟同樣品有效活菌數(shù)檢測(cè)操作。

7.2.6.2 允許差

平行樣品誤差按式（ 3）計(jì)算，并應(yīng)符合表2的規(guī)定。

……………… (3)

                表2 平板上菌落數(shù)對(duì)應(yīng)的單一標(biāo)準(zhǔn)差

7.2.6.3 測(cè)定結(jié)果的計(jì)算

按式（ 4）、式（5）計(jì)算樣品的有效活菌數(shù)及雜菌率

有效活菌數(shù)（個(gè) /g）=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×母液菌懸液的體積/菌劑克數(shù)或毫升數(shù)/加樣量 …………(4)

雜菌率 (%)=雜菌總數(shù)/（固氮菌數(shù)+雜菌總數(shù)）×100              …………………(5)

7.2.7有效期檢驗(yàn)

在產(chǎn)品說(shuō)明書標(biāo)明的有效期到達(dá)前 10d測(cè)定成品各項(xiàng)指標(biāo)，方法同7.2.1 ~ 7.2.6。

8 檢驗(yàn)規(guī)則

8.1 檢驗(yàn)分類

8.1.1 產(chǎn)品出廠檢驗(yàn)

產(chǎn)品交貨時(shí)進(jìn)行的檢驗(yàn)。

8.1.2 產(chǎn)品型式檢驗(yàn)

新產(chǎn)品鑒定或國(guó)家質(zhì)檢機(jī)構(gòu)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)。

8.2 檢驗(yàn)項(xiàng)目

型式檢驗(yàn)的檢驗(yàn)項(xiàng)目按 5.2要求進(jìn)行。出廠檢驗(yàn)不檢有效期。

8.3 判定規(guī)則

8.3.1 合格產(chǎn)品:

a)       檢驗(yàn)結(jié)果符合 5.2所規(guī)定的技術(shù)指標(biāo)的產(chǎn)品為合格產(chǎn)品；

b)       產(chǎn)品有效活菌數(shù)符合指標(biāo)，雜菌率不符合指標(biāo)，但小于本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的兩倍時(shí)（液體 10%、固體30%、凍干瓶4%），而且在馬丁培養(yǎng)基平板上霉菌數(shù)小于30×10 -5 ，其他指標(biāo)有一項(xiàng)不符合，也可判為合格產(chǎn)品；

c)       產(chǎn)品有效活菌數(shù)及雜菌率符合指標(biāo)，在水分、外觀、 pH值、細(xì)度等次要檢測(cè)項(xiàng)目中，有3項(xiàng)不符合技術(shù)指標(biāo)，也判為合格產(chǎn)品。

8.3.2 不合格產(chǎn)品:

a)        產(chǎn)品有效活菌數(shù)不符合技術(shù)指標(biāo)或投入菌種沒(méi)有完全相應(yīng)的檢驗(yàn)出，判為不合格產(chǎn)品；

b)        產(chǎn)品雜菌率超過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的兩倍（液體 10%、固體30%、凍干瓶4%），判為不合格品；

c)        產(chǎn)品有效活菌數(shù)符合指標(biāo)，雜菌率不符合指標(biāo)，但小于本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的兩倍時(shí)（液體 10%、固體30%、凍干瓶4%），其他指標(biāo)有兩項(xiàng)不符合，判為不合格產(chǎn)品；

d)        產(chǎn)品檢驗(yàn)在馬丁培養(yǎng)基平板上霉菌數(shù)≥ 30×10 -5 ，判為不合格產(chǎn)品；

e)        產(chǎn)品水分、 pH值、細(xì)度、外觀等次要檢測(cè)項(xiàng)目中，有4項(xiàng)不符合技術(shù)指標(biāo)，判為不合格產(chǎn)品。

8.3.3 含有植物促生根際細(xì)菌（PGPR）的固氮菌肥料產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)，只測(cè)固氮菌數(shù)量，不測(cè)植物促生根際細(xì)菌的數(shù)量，也不視其為雜菌。

8.3.4 本標(biāo)準(zhǔn)中質(zhì)量指標(biāo)合格判斷，采用GB/T 1250中修約值比較。

9 包裝、標(biāo)識(shí)、運(yùn)輸和貯存

9.1 包裝

9.1.1 內(nèi)包裝

液體肥料小包裝用塑料瓶或玻璃瓶，大包裝用塑料桶。固體肥料用不透明聚乙烯塑料袋包裝。凍干菌劑用玻璃指形管真空干燥。

9.1.2 外包裝

外包裝采用紙箱，紙箱質(zhì)量應(yīng)符合 GB/T 6543要求。箱外用尼龍打包帶加固。

9.1.3 每箱(袋)產(chǎn)品中附有產(chǎn)品合格證和使用說(shuō)明書，在使用說(shuō)明中標(biāo)明使用方法、用量及注意事項(xiàng)。

9.2 標(biāo)識(shí)

在包裝箱 (袋)上印有產(chǎn)品名稱、商標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)、肥料登記證號(hào)、生產(chǎn)單位、廠址、生產(chǎn)日期、批號(hào)和凈重，并印有防曬、防潮、防凍等標(biāo)記，若有必要還要加印易碎、防倒置等標(biāo)記。內(nèi)包裝上有產(chǎn)品名稱、商標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)、肥料登記證號(hào)、有效菌含量、生產(chǎn)日期、有效期、產(chǎn)品性能、使用說(shuō)明書及生產(chǎn)單位、廠址等。

9.3 運(yùn)輸

適用于常用運(yùn)輸工具，運(yùn)輸過(guò)程中有遮蓋物，防止雨淋、日曬及 35℃以上高溫。氣溫低于0℃時(shí)采取保溫措施，防止菌肥凍冰。運(yùn)輸過(guò)程中輕裝輕卸，避免包裝破損。

9.4 貯存

產(chǎn)品貯存在陰涼、干燥、通風(fēng)的庫(kù)房?jī)?nèi)，最適溫度為 10℃ ~ 25℃，不得露天堆放，以防雨淋和日曬，避免凍冰及長(zhǎng)時(shí)間35℃以上高溫。

附錄 A

(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)

有效活菌數(shù)和雜菌（霉菌）測(cè)定的選擇培養(yǎng)基

A1、固氮菌用阿須貝（Ashby）培養(yǎng)基

磷酸二氫鉀（ KH 2 PO 4 ） 0.2g

硫酸鎂（ MgSO 4 ?7H 2 O） 0.2g

氯化納 (NaCl) 0.2g

碳酸鈣 (CaC0 3 ) 5.0g

甘露醇（ C 6 H 14 O 6 ） 10.0g

硫酸鈣 (CaS0 4 ?7H 2 O) 0.lg

pH值 7.0

A2、固氮（莖瘤）根瘤菌培養(yǎng)基

乳酸鈉（ C 3 H 5 O 3 Na） 10.0g

磷酸氫二鉀（ K 2 HPO 4 ） 1.67g

磷酸二氫鉀（ KH 2 PO 4 ） 0.87g

氯化納 (NaCl) 0.05g

氯化鈣 (CaCl 2 ) 0.04g

氯化鐵 (FeCl 3 ) 0.004g

硫酸鎂 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.1g

酵母膏 1.0g

（或酵母粉 0.8g）

pH 6.8

A3、聯(lián)合固氮菌培養(yǎng)基

D-葡萄糖酸鈉（C 6 H 11 O 7 Na） 5.0g

磷酸二氫鉀（ KH 2 PO 4 ） 0.4g

磷酸氫二鉀（ K 2 HPO 4 ） 0.1g

硫酸鎂 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.2g

氯化納 (NaCl) 0.1g

氯化鈣 (CaCl 2 ) 0.02g

氯化鐵 (FeCl 3 ) 0.01g

硫酸鎂 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.1g

酵母膏 1.0g

（或酵母粉 0.8g）

鉬酸鈉 (Na 2 Mo0 4 ) 0.002g

pH 6.8~7.0

A4、馬丁培養(yǎng)基（測(cè)霉菌數(shù)）

磷酸氫二鉀（ K 2 HPO 4 ） 1.0g

硫酸鎂 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.5g

葡萄糖（ C 6 H 12 O 6 ?H 2 0） 10.0g

蛋白胨 5.0g

1%孟加拉紅水溶液 3.3mL

[四氯四碘熒光素（C 20 H 4 Cl 4 I 4 O 5 ）]

每升培養(yǎng)基中加入 0.1g氯霉素，一起滅菌。

注：以上各培養(yǎng)基需蒸餾水 1000mL，瓊脂18 ~ 20g。

附錄 B

（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）

染色劑和染色方法

B1 莢膜染色法

B1.1 染色劑

石碳酸復(fù)紅染色液

甲液：堿性復(fù)紅 (Basicfuchsin)(C 20 H 20 ClN 3 ) 0.3g

95%酒精 10.0mL

乙液：石碳酸（ C 6 H 5 OH） 5.0g

蒸餾水 95.0mL

a）將堿性復(fù)紅在研缽中研磨后，逐漸加入95%酒精，繼續(xù)研磨使之溶解，配成甲液。

b）將石碳酸溶解在蒸餾水中配成乙液。

c）將甲液和乙液混合搖勻，成為石碳酸復(fù)紅，通�？蓪⒒旌弦合♂�5~10倍使用。稀釋液容易變質(zhì)失效，一次不宜多配。

B1.2 染色方法

B1.2.1 取少量培養(yǎng)菌液涂于載玻片水滴中，涂成薄層。

B1.2.2 自然干燥或稍加熱。

B1.2.3 在石碳酸復(fù)紅染1min后，水洗，干后鏡檢。

B1.3 染色結(jié)果

菌體為紅色，菌體周圍有一層透明圈即為莢膜。

B2 芽胞染色法

B2.1 染色劑

B2.1.1 5%孔雀綠

孔雀綠（ C 23 H 25 ClN 2 ） 5.0g

蒸餾水 100mL

B2.1.2 0.05%堿性復(fù)紅

堿性復(fù)紅 (Basicfuchsin)(C 20 H 20 ClN 3 ) 0.5g

95%酒精 100mL

B2.2 染色方法

B2.2.1 制片

B2.2.2 加孔雀綠染液3~5滴于涂片處，酒精燈火焰加熱至冒汽，但不沸騰，并隨時(shí)補(bǔ)加染液，維持涂片處不干，染色約5~10min。

B2.2.3 自來(lái)水沖洗30s。

B2.2.4 用0.05%堿性復(fù)紅染色1min，水洗，鏡檢（若0.05%堿性復(fù)紅濃度太高，可根據(jù)具體情況適當(dāng)稀釋）。

B2.3 染色結(jié)果

芽胞綠色，菌體紅色。

B3 革蘭氏染色法

B3.1 染色劑

B3.1.1 結(jié)晶紫染色液

甲液：結(jié)晶紫 2g

乙醇 (95%) 20mL

乙液：草酸鍍 0.8g

蒸餾水 80mL

甲、乙液相混合，靜置 48h后使用。

B3.1.2 盧哥(Lugol)氏碘液

碘 (I 2 )片 1.0g

碘化鉀 (KI) 2.0g

蒸餾水 300mL

先用少量 (3~5mL)蒸餾水溶解碘化鉀，再投入碘片，待碘全溶后，加水100mL，配成母液，使用時(shí)加兩倍水，稀釋成盧哥氏碘液。

B3.1.3 脫色液(95%的乙醇)

B3.1.4 復(fù)染液(0.5%的番紅水溶液)

取 2.5g番紅，溶于l00mL無(wú)水酒精中。取番紅酒精溶液20mL，加入80mL蒸餾水，即成0.5%的番紅水溶液。

B3.2 染色方法

B3.2.1 制片

B3.2.2滴加結(jié)晶紫液，覆蓋1min。

B3.2.3 用水沖凈結(jié)晶紫液。

B3.2.4 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1min。

B3.2.5 用水沖去碘液，用吸水紙吸去水分。

B3.2.6 加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，30s后水洗，吸去水分。

B3.2.7 番紅染色液染10s后，自來(lái)水沖洗。干燥，鏡檢。

B3.3 染色結(jié)果

革蘭氏正反應(yīng)菌體呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體呈紅色。

B4 鞭毛染色

B4.1 染色劑

甲液：?jiǎn)螌幩幔?nbsp;C 76 H 52 O 46 ） 5.0g

氯化鐵（ FeCl 3 ） 1.5g

15%甲醛（HCHO） 2.0mL

1%氫氧化鈉（NaOH） 1.0mL

蒸餾水 100mL

乙液：硝酸銀（ AgNO 3 ） 2g

蒸餾水 100mL

待硝酸銀溶解后，取出 10mL備用，其余的90mL硝酸銀液中滴加濃氫氧化銨，則形成很厚的沉淀，再繼續(xù)滴加氫氧化銨到剛剛?cè)芙獬恋沓蔀槌吻迦芤簽橹�。再將備用的硝酸銀慢慢滴入，則出現(xiàn)薄霧，但輕輕搖動(dòng)后，薄霧狀的沉淀又消失，再滴入硝酸銀，直到搖動(dòng)后，仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止（如霧重，則銀鹽沉淀出，不宜使用）。

B4.2 染色方法

B4.2.1 涂片：在載玻片的一端滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取斜面上少許菌苔，在載玻片的水滴中輕蘸幾下。將玻片稍傾斜，使菌液隨水滴緩慢流到另一端，然后平放在空氣中干燥。

B4.2.2 涂片干燥后，滴加甲液3~5min，用蒸餾水沖洗。加乙液染30~60s，并在酒精燈上加熱，使其稍冒汽而染液不干，然后用蒸餾水沖洗，干后鏡檢。

B4.3 染色結(jié)果

菌體為深褐色，鞭毛為褐色。

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